蛋白質測定常用的方法是凱氏定氮法，它是通過測定氮含量從而換算成蛋白質的方法，是上通用的標準方法，其優點為實驗操作簡單、方便，測量結果的重復性和重現性好，而被廣泛應用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質含量測定中。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法，其原理是食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個步驟，其原理較為復雜，使用的試劑也比較多，以下將對這四個步驟進行簡單講述。
1、樣品(pin)的取樣
取(qu)樣應具有(you)代表性(xing)，取(qu)樣前將樣品(pin)充分混勻，固體試(shi)樣可用粉碎設(she)備制(zhi)成細小均(jun)勻粉末(mo)。稱量(liang)放入凱氏定氮瓶時，切(qie)勿使樣品(pin)粘附在(zai)瓶頸(jing)部，避(bi)免樣品(pin)未消化而(er)造成氮損失(shi)。
2、樣品(pin)的消化
樣品中(zhong)含氮(dan)有(you)機(ji)(ji)化(hua)合(he)物(wu)經硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)在(zai)加熱(re)的(de)(de)條件(jian)下消(xiao)化(hua)，硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)的(de)(de)作(zuo)用促使有(you)機(ji)(ji)物(wu)脫水(shui)炭化(hua)。含氮(dan)的(de)(de)有(you)機(ji)(ji)物(wu)炭化(hua)并生(sheng)成(cheng)碳，碳在(zai)將硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)還(huan)原(yuan)(yuan)為(wei)二(er)(er)氧(yang)(yang)化(hua)硫(liu)(liu)(liu)的(de)(de)反應中(zhong)，自身(shen)則被氧(yang)(yang)化(hua)成(cheng)為(wei)二(er)(er)氧(yang)(yang)化(hua)碳；反應過(guo)(guo)程中(zhong)產生(sheng)的(de)(de)二(er)(er)氧(yang)(yang)化(hua)硫(liu)(liu)(liu)將氮(dan)還(huan)原(yuan)(yuan)為(wei)氨(an)(an)氣(qi)，此(ci)過(guo)(guo)程中(zhong)其自身(shen)則被氧(yang)(yang)化(hua)成(cheng)三氧(yang)(yang)化(hua)硫(liu)(liu)(liu)；而消(xiao)化(hua)過(guo)(guo)程生(sheng)成(cheng)的(de)(de)氫，又加速了氨(an)(an)的(de)(de)形(xing)成(cheng)。生(sheng)成(cheng)的(de)(de)水(shui)以水(shui)蒸(zheng)氣(qi)的(de)(de)形(xing)式連同(tong)反應過(guo)(guo)程中(zhong)生(sheng)成(cheng)的(de)(de)三氧(yang)(yang)化(hua)硫(liu)(liu)(liu)一同(tong)逸出，而氨(an)(an)氣(qi)則以硫(liu)(liu)(liu)酸(suan)(suan)銨(an)的(de)(de)形(xing)式留在(zai)消(xiao)化(hua)液中(zhong)。
化(hua)學反應方程(cheng)式為：
2NH2（CH2）2COOH＋13H2SO4→（NH4）2SO4＋CO2↑＋SO2↑＋16H2O
此過(guo)(guo)程(cheng)的(de)注(zhu)意事項：①樣品(pin)(pin)(pin)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)(shi)，對于含糖量(liang)(liang)(liang)很高(gao)(gao)(gao)或(huo)含脂(zhi)量(liang)(liang)(liang)較多的(de)樣品(pin)(pin)(pin)，應(ying)注(zhu)意要(yao)緩慢升(sheng)溫(wen)加(jia)(jia)熱(re)(re)，并(bing)隨時(shi)(shi)(shi)(shi)注(zhu)意控制加(jia)(jia)熱(re)(re)的(de)溫(wen)度(du)，避免產生大量(liang)(liang)(liang)泡沫噴出或(huo)噴濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)，造成樣品(pin)(pin)(pin)的(de)損失。若(ruo)因(yin)加(jia)(jia)熱(re)(re)溫(wen)度(du)不(bu)當，局部溫(wen)度(du)過(guo)(guo)高(gao)(gao)(gao)使(shi)(shi)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)噴濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)，應(ying)及時(shi)(shi)(shi)(shi)轉(zhuan)動凱氏定(ding)氮(dan)瓶(ping)將(jiang)濺到(dao)瓶(ping)壁(bi)上(shang)的(de)樣品(pin)(pin)(pin)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)沖(chong)下(xia)，也可(ke)在樣品(pin)(pin)(pin)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)前加(jia)(jia)入少(shao)(shao)量(liang)(liang)(liang)辛(xin)醇或(huo)液(ye)(ye)(ye)(ye)體石蠟，以減少(shao)(shao)泡沫的(de)產生。②消(xiao)化(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)(shi)應(ying)不(bu)定(ding)時(shi)(shi)(shi)(shi)旋轉(zhuan)凱氏定(ding)氮(dan)瓶(ping)，將(jiang)附在瓶(ping)壁(bi)上(shang)的(de)碳粒沖(chong)下(xia)，使(shi)(shi)樣品(pin)(pin)(pin)充分消(xiao)化(hua)(hua)(hua)。③若(ruo)樣品(pin)(pin)(pin)難(nan)以消(xiao)化(hua)(hua)(hua)至(zhi)澄(cheng)清透明(ming)的(de)程(cheng)度(du)，可(ke)將(jiang)凱氏定(ding)氮(dan)瓶(ping)從加(jia)(jia)熱(re)(re)器上(shang)取下(xia)，待其中溶液(ye)(ye)(ye)(ye)冷卻(que)至(zhi)室溫(wen)后，向消(xiao)化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)中加(jia)(jia)入少(shao)(shao)量(liang)(liang)(liang)過(guo)(guo)氧化(hua)(hua)(hua)氫，再(zai)繼續加(jia)(jia)熱(re)(re)直至(zhi)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)。④整個消(xiao)化(hua)(hua)(hua)過(guo)(guo)程(cheng)中硫酸(suan)(suan)(suan)的(de)量(liang)(liang)(liang)要(yao)充足，以保(bao)證樣品(pin)(pin)(pin)中含氮(dan)有機化(hua)(hua)(hua)合物(wu)的(de)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)。樣品(pin)(pin)(pin)中脂(zhi)肪含量(liang)(liang)(liang)過(guo)(guo)高(gao)(gao)(gao)時(shi)(shi)(shi)(shi)，要(yao)增加(jia)(jia)硫酸(suan)(suan)(suan)的(de)量(liang)(liang)(liang)，因(yin)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)時(shi)(shi)(shi)(shi)脂(zhi)肪消(xiao)耗(hao)硫酸(suan)(suan)(suan)的(de)量(liang)(liang)(liang)較大，使(shi)(shi)硫酸(suan)(suan)(suan)缺(que)少(shao)(shao)而影響(xiang)測定(ding)。⑤在樣品(pin)(pin)(pin)消(xiao)化(hua)(hua)(hua)末(mo)期，即消(xiao)化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)呈藍綠色并(bing)澄(cheng)清透明(ming)后，再(zai)繼續加(jia)(jia)熱(re)(re)半(ban)小(xiao)時(shi)(shi)(shi)(shi)即可(ke)，因(yin)此時(shi)(shi)(shi)(shi)瓶(ping)內消(xiao)化(hua)(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)溫(wen)度(du)過(guo)(guo)高(gao)(gao)(gao)，若(ruo)長時(shi)(shi)(shi)(shi)間加(jia)(jia)熱(re)(re)，會(hui)使(shi)(shi)生成的(de)硫酸(suan)(suan)(suan)氫銨分解并(bing)釋(shi)放出
氨氣，使氮的(de)含(han)量損失，從而影響測(ce)定(ding)結果。
3、蒸(zheng)餾
化學反應(ying)方程式(shi)為：
（NH4）2SO4＋NaOH→Na2SO4＋NH3↑＋H2O
注意事項：①水(shui)(shui)蒸氣發生器(qi)中(zhong)(zhong)的(de)水(shui)(shui)要呈酸(suan)(suan)性，因(yin)水(shui)(shui)中(zhong)(zhong)可(ke)(ke)能(neng)含(han)(han)有微量(liang)(liang)的(de)氨離(li)(li)子，防止(zhi)其(qi)受(shou)熱(re)溢出(chu)而(er)(er)影響測(ce)定結(jie)(jie)果(guo)。②蒸餾反(fan)應(ying)過程中(zhong)(zhong)，硫(liu)酸(suan)(suan)銨為(wei)(wei)(wei)強酸(suan)(suan)弱堿(jian)(jian)鹽，可(ke)(ke)使(shi)消(xiao)化(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)為(wei)(wei)(wei)弱酸(suan)(suan)性溶(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye)。為(wei)(wei)(wei)保證測(ce)量(liang)(liang)結(jie)(jie)果(guo)的(de)準確(que)性，務(wu)必使(shi)結(jie)(jie)合態的(de)氨能(neng)反(fan)應(ying)并釋(shi)放出(chu)來，因(yin)此整(zheng)個(ge)(ge)蒸餾過程中(zhong)(zhong)，堿(jian)(jian)液(ye)(ye)(ye)(ye)的(de)量(liang)(liang)不(bu)足，酸(suan)(suan)堿(jian)(jian)中(zhong)(zhong)和(he)反(fan)應(ying)則不(bu)，很難達到使(shi)氨充分(fen)(fen)分(fen)(fen)離(li)(li)的(de)目的(de)，從而(er)(er)使(shi)測(ce)量(liang)(liang)結(jie)(jie)果(guo)不(bu)準確(que)。氫(qing)氧化(hua)(hua)鈉溶(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye)既能(neng)中(zhong)(zhong)和(he)樣品(pin)消(xiao)化(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)過量(liang)(liang)的(de)酸(suan)(suan)，又(you)可(ke)(ke)為(wei)(wei)(wei)氨的(de)有效分(fen)(fen)離(li)(li)提(ti)供(gong)一個(ge)(ge)堿(jian)(jian)性環(huan)境(jing)，因(yin)此氫(qing)氧化(hua)(hua)鈉的(de)用量(liang)(liang)要控制適(shi)當。實驗者可(ke)(ke)利用消(xiao)化(hua)(hua)液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)含(han)(han)有的(de)銅離(li)(li)子，根(gen)據其(qi)特征顏色作為(wei)(wei)(wei)堿(jian)(jian)性反(fan)應(ying)的(de)指(zhi)示劑。當反(fan)應(ying)室(shi)內加(jia)入氫(qing)氧化(hua)(hua)鈉溶(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye)后，其(qi)溶(rong)液(ye)(ye)(ye)(ye)顏色立即(ji)變為(wei)(wei)(wei)藍黑(hei)色時(shi)，表明氫(qing)氧化(hua)(hua)鈉已(yi)過量(liang)(liang)，能(neng)達到酸(suan)(suan)堿(jian)(jian)反(fan)應(ying)的(de)要求，可(ke)(ke)保證反(fan)應(ying)進行。③加(jia)氫(qing)氧化(hua)(hua)鈉的(de)漏(lou)斗(dou)要采用水(shui)(shui)封，避免(mian)因(yin)蒸餾裝置漏(lou)氣造成氨的(de)溢出(chu)而(er)(er)影響測(ce)定結(jie)(jie)果(guo)。
4、滴定
氨(an)以氣(qi)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形式(shi)被(bei)釋放出來，用(yong)硼(peng)酸(suan)(suan)(suan)溶(rong)液(ye)吸(xi)(xi)收后(hou)，使(shi)(shi)用(yong)鹽酸(suan)(suan)(suan)或硫酸(suan)(suan)(suan)標(biao)準(zhun)滴定液(ye)進(jin)行(xing)酸(suan)(suan)(suan)堿(jian)滴定，從而計算出樣(yang)品(pin)中(zhong)蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含量(liang)(liang)。此過程的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注意事項：①硼(peng)酸(suan)(suan)(suan)吸(xi)(xi)收液(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)溫(wen)度(du)不宜過高(gao)，過高(gao)則氨(an)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸(xi)(xi)收能(neng)力將減(jian)弱，會影響(xiang)(xiang)測量(liang)(liang)結果(guo)，使(shi)(shi)結果(guo)偏低(di)。方式(shi)是保(bao)(bao)持溶(rong)液(ye)溫(wen)度(du)在(zai)20℃以下，或將接收瓶置于冷水(shui)浴中(zhong)。②硼(peng)酸(suan)(suan)(suan)吸(xi)(xi)收液(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體積不使(shi)(shi)用(yong)精密量(liang)(liang)取，只(zhi)要(yao)保(bao)(bao)證能(neng)將氨(an)全部吸(xi)(xi)收即可(ke)，因為(wei)硼(peng)酸(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)(suan)(suan)性很弱，不會影響(xiang)(xiang)滴定。③滴定用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準(zhun)滴定液(ye)必須按照要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)配制和標(biao)定，因其準(zhun)確度(du)直(zhi)接影響(xiang)(xiang)測量(liang)(liang)結果(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)準(zhun)確性。④計算蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含量(liang)(liang)時須乘以氮換算蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)系(xi)數，一般(ban)食物為(wei)6。25。
5、小結
新(xin)鮮食品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)(de)含(han)氮(dan)化(hua)合物(wu)大都以蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)為(wei)(wei)主(zhu)體，所以檢(jian)驗(yan)(yan)食品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)含(han)量(liang)時，只限于測(ce)定(ding)總氮(dan)量(liang)，然后(hou)乘以蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)換算(suan)系數6。25，即可得(de)到蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)含(han)量(liang)。凱氏(shi)定(ding)氮(dan)法可用于所有(you)(you)動、植物(wu)食品(pin)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)，因樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)常含(han)有(you)(you)核酸、生物(wu)堿(jian)等以及含(han)氮(dan)色素等非蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)含(han)氮(dan)化(hua)合物(wu)，所以該法測(ce)定(ding)結(jie)(jie)果(guo)為(wei)(wei)粗蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)含(han)量(liang)。筆者通過(guo)參加(jia)國家機構組織的(de)(de)“食品(pin)中(zhong)(zhong)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)測(ce)定(ding)”能(neng)力檢(jian)驗(yan)(yan)證，以反(fan)復實(shi)(shi)驗(yan)(yan)為(wei)(wei)基礎，在(zai)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)過(guo)程中(zhong)(zhong)摸(mo)索(suo)可能(neng)影響(xiang)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)結(jie)(jie)果(guo)的(de)(de)關鍵點和注(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)，嚴格把握實(shi)(shi)驗(yan)(yan)原(yuan)理，多次推敲與總結(jie)(jie)，得(de)到上述實(shi)(shi)驗(yan)(yan)經驗(yan)(yan)。
參(can)考文(wen)獻
［1］馬(ma)丹。凱氏(shi)定氮(dan)法測(ce)定食品中蛋白質含量［J］。計量與測(ce)試技術，2008，35（06）：57－58。
［2］王(wang)燕。食品檢(jian)驗技(ji)術（理化部分）［M］。1版。北京：中(zhong)國(guo)輕工業出(chu)版社，2012：102－110。
［3］中華(hua)人民(min)共和國(guo)(guo)國(guo)(guo)家藥(yao)典委員會。中國(guo)(guo)藥(yao)典［M］。1版(ban)。北(bei)京(jing)：中國(guo)(guo)醫藥(yao)科技(ji)出版(ban)社，2010：53。
［4］張(zhang)朝武。現代衛生檢驗［M］。1版。北京：人民衛生出版社(she)，2005：24－56。
［5］中(zhong)(zhong)國藥品(pin)生物制品(pin)檢定(ding)所，中(zhong)(zhong)國藥品(pin)檢驗總所。藥品(pin)檢驗儀器標準操作規(gui)程［M］。1版。北京：中(zhong)(zhong)國醫藥科(ke)技(ji)出版社(she)，2010：181－183。
歡迎來到濟南阿爾瓦儀器有限公司！
